Agrobiotechnologia

1. NOWOCZESNE TECHNIKI W ANALITYCE I PREPARATYCE BIOCHEMICZNEJ

(plan kursu)

Wykład - 20 godzin
Konwersatorium - 5 godzin
Laboratorium - 75 godzin

Część I - analityczna
Wykład : podstawowe techniki identyfikacji i oznaczania niskocząsteczkowych substancji (hormony roślinne, regulatory wzrostu, pestycydy) w materiale roślinnym. Wykorzystanie metod spektrofotometrycznych i spektrofluorymetrycznych.
Metody chromatograficzne - GC, HPL w połączeniu ze spektrometrią masową w identyfikacji związków chemicznych.
Metody immunochemiczne - znakowanie i lokalizacja składników komórki w mikroskopie konfokalnym. Wykrywanie patogenów techniką ELISA.

Laboratorium: Spektrofotometryczna i spektrofluorometrycza analiza mieszanin wieloskładnikowych. Oznaczanie hormonów roślinnych metodą GC-MS. Immunolokalizacja wybranych białek w komórce roślinnej metodą mikroskopii konfokalnej.

Konwersatorium: analiza uzyskanych wyników, sposoby interpretacji danych, porównanie metod analitycznych.

Część II - preparatywna
Wykład: strategia oczyszczania białek ważnych komercyjnie. Wykorzystanie metod chromatograficznych (IEX, HIC, powinowactwa, IMAC, chromatofokusingu) i elektroforetycznych (SDS- PAGE, gradient- PAGE, ogniskowania izoelektrycznego) do izolacji i charakterystyki enzymów. Metody immobilizacji enzymów na skalę przemysłową.

Laboratorium: ekstrakcja i oczyszczanie enzymów modelowych (peroksydaza, inwertaza, amylazy) różnymi metodami chromatograficznymi- porównanie efektywności.
Charakterystyka uzyskanych preparatów i ich immobilizacja poprzez jonowe i kowalencyjne wiązanie z nośnikiem, pułapkowanie oraz techniką sieciowanych agregatów (CLEA). Zastosowanie tych preparatów w prostych reaktorach enzymatycznych.

Konwersatorium: krytyczna analiza stosowanych metod oczyszczania (wydajność, koszty), optymalna strategia oczyszczania danego enzymu, alternatywne metody immobilizacji i potencjalne matryce.



2. EKSPRESJA, REFOLDING I OCZYSZCZANIE REKOMBINOWANYCH BIAŁEK UŻYTECZNYCH W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM I ROLNICTWIE

Czas trwania: 2 tygodnie (kurs wakacyjny), 15 godz. wykładów, 30 godz. ćwiczeń
Założenia: Kurs przeznaczony jest dla studentów Biotechnologii na specjalności Agrobiotechnologia, którzy ukończyli podstawowy kurs biochemii i genetyki. Jego celem jest zapoznanie studentów z biotechnologicznymi i biochemicznymi metodami produkcji (nadekspresji), renaturacji oraz oczyszczania rekombinowanych białek, które znajdą zastosowanie w rolnictwie i przemyśle przetwórczym.
Kurs kończy się uzyskaniem certyfikatu zaświadczającego o uzyskanych umiejętnościach.
Prowadzący: dr hab. Michał Komoszyński prof. UMK
mgr Dorota Ściesińska, mgr Mariusz Banach

Tematyka wykładów:
1. Biotechnologia w produkcji białek i enzymów
-analiza i przeszukiwanie baz danych bibliotek cDNA i białek
- białka w przemyśle i rolnictwie
- rodzaje wektorów i systemów ekspresyjnych
- metody wprowadzania wektora do komórek
2. Nadekspresja białek eukariotycznych w prokariotycznych systemach ekspresyjnych
- charakterystyka prokariotycznych systemów ekspresyjnych
- budowa wektora ekspresyjnego
- kompetencja i proces transformacji w komórkah bakteryjnych
- regulacja ekspresji genów w komórkach bakteryjnych
3. Ciała inkluzyjne
- skład i struktura
- mechanizmy tworzenia w komórkach bakteryjnych
- sposoby zapobiegania tworzenia
- izolacja z komórek bakteryjnych
4. Renaturacja białek z ciał inkluzyjnych
- metody renaturacji białek (rozcieńczanie, dializa, refolding na kolumnie)
- czynniki fizyczne i chemiczne wpływające na proces refoldingu
- czynniki biologiczne zwiększające wydajność refoldingu - chaperony (budowa, mechanizm działania)
5. Oczyszczanie białek rekombinowanych
- metody oczyszczania białek

Tematyka ćwiczeń:

1. Zajęcia organizacyjne - zapoznanie się z zasadami pracy w laboratorium
2. Transformacja komórek bakteryjnych
3. Ekspresja białek eukariotycznych w komórkach bakteryjnych
4. Izolacja i oczyszczanie ciał inkluzyjnych z komórek bakteryjnych
5. Renaturacja białka zakumulowanego w ciałach inkluzyjnych
6. Oczyszczanie zrefoldingowanego białka
7. Analiza aktywności renaturowanego białka
8. Analiza jakościowa i ilościowa renaturowanego białka- elektroforeza denaturująca, elektroforeza natywna, Western Blotting



3. HODOWLE TKANKOWE I KOMÓRKOWE ZWIERZĄT I ROŚLIN

Kurs przeznaczony jest dla studentów biotechnologii o specjalności agrobiotechnologia.
Kurs kończy się uzyskaniem certyfikatu zaświadczającego o uzyskanych umiejętnościach.

Czas trwania: 2 tygodnie (kurs wakacyjny) po ukończeniu III roku studiów, zajęcia obejmują 10 godz. wykładów, 10 godz. konwersatoriów, 40 godz. ćwiczeń w grupach 5-osobowych.

Założenia: Uzupełnienie wiedzy dotyczącej kultur tkankowych roślinnych i zwierzęcych. Rozszerzenie oraz doskonalenie umiejętności manualnych w pracy z materiałem roślinnym i zwierzęcym w warunkach in vitro. Poznanie nowych technik izolacji i zasad pracy z różnym typem materiału zarówno roślinnego jak i zwierzęcego. Przygotowanie preparatów z kallusa i ocena ich jakości. Zakładanie hodowli pierwotnych komórek zwierzęcych.

Tematyka wykładów:
1. Wykorzystanie kalusa do masowego namnażania roślin.
2. Wpływ różnych typów cytokinin na organogenezę i morfologię pędów przybyszowych wybranych gatunków roślin.
3. Arabidopsis jako roślina modelowa w badaniach naukowych. Rola auksyn w regulacji organogenezy in vitro.
4. Niehormonalne czynniki regulacji powstawania i morfologii korzeni.
5. Wykorzystanie kultur protoplastów w agrobiotechnologii.
6. Hodowla komórek zwierzęcych istotnym składnikiem badań naukowych w naukach biologicznych.
7. Środowisko hodowlane - sterylność, pożywki, substraty.
8. Rola tlenu, CO2, ciśnienia osmotycznego i temperatury w hodowlach komórek zwierzęcych.
9. Wybór materiału do hodowli, hodowle pierwotne, linie komórkowe i hodowle przestrzenne. Zakładanie hodowli, mnożenie i przechowywanie uzyskanego materiału.
10. Ocena wzrostu i jakości komórek podczas hodowli.
Tematyka konwersatoriów:

1. Drogi regeneracji, kierunki organogenezy, czynniki hormonalne i niehormonalne wpływające na regenerację. Wykorzystanie hodowli in vitro w biotechnologii (5 godz.).
2. Komórki macierzyste: źródła pozyskiwania, sposoby hodowli, kierunki i kontrola różnicowania in vivo oraz in vitro. Perspektywy wykorzystania komórek macierzystych w terapii (5 godz.).

Tematyka ćwiczeń:
1. Wykorzystanie kultur kalusa do masowego namnażania roślin, sadzonkowanie in vitro.
2. Mikropropagacja jako metoda w ochronie zagrożonych gatunków.
3. Organogeneza pośrednia u Arabidopsis thaliana z wykorzystaniem roślin transgenicznych z genem reporterowym GFP.
4. Izolacja protoplastów z aparatów szparkowych, mezofilu i wierzchołków wzrostu korzeni Allium cepa, Nicotiana tabacum i Beta vulgaris.
5. Wpływ substancji odżywczych na architekturę systemu korzeniowego.
6. Organizacja pracowni hodowli komórek zwierzęcych, zapoznanie się ze składem podstawowych pożywek do hodowli komórek zwierzęcych, warunki prowadzenia hodowli komórkowych, sterylizacja.
7. Hodowla ustalonych linii komórkowych na przykładzie glejaka C6: zakładanie hodowli, prowadzenie hodowli linii komórek adherentnych, pasażowanie.
8. Metody mrożenia i rozmrażania komórek, sposoby liczenia komórek, ocena ich przeżywalności. Ocena integralności komórek w hodowlach in vitro.
9. Zakładanie hodowli pierwotnych komórek prawidłowych (fibroblasty, komórki neuronalne).
10. Immunocytochemiczna lokalizacja wybranych białek, zastosowanie białek markerowych w identyfikacji i selekcji komórek. Dokumentacja fotograficzna hodowli.